玻璃棒

WB条带出现各种状况?或许这里的方法适合你!

作者:上海勤翔 / 关注公众号:Clinx2018  发布:2019-07-13

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Western Blot (简称:WB)是一种运用于分子生物学、生物化学等生物基础学科研究的常用实验方法。然而WB的实验步骤繁琐,导致我们在做实验时会遇到各式各样的问题。这里,我们总结了一些WB实验中经常遇到的问题,并推荐常用的解决方法,希望对大家有所帮助。
1. 目标条带没有信号
原因分析
解决方法
样品中可能含有蛋白酶,使蛋白样品分解成小分子。
添加蛋白酶抑制剂。
目标蛋白浓度过低(低于检测下线)。
加大上样量或提高目标蛋白浓度。
转膜时间太短导致目标蛋白没有充分转移到膜上,或者转膜时间过长导致样品转穿。
控制转膜时间并选择适合的转印膜。
一抗的特异性不佳,导致一抗无法识别目标蛋白。
选用高品质抗体。
一抗反复使用后导致效价降低,尽管还能与目标蛋白连接,但连接蛋白的数量太少。
一抗不宜反复使用。
洗脱过渡导致与一抗相结合的目标蛋白被洗掉。
洗脱时间的时间和频率应有效控制,一般建议3次10分钟。
2. 图片背景过高,难以分辨条带
原因分析
解决方法
一抗浓度太高,导致抗体非特异性结合。
降低一抗浓度。
洗膜的时间和次数不够,导致其他蛋白没有清洗干净。
提高洗脱时间和频率。封闭物用量不足。‍提高封闭物浓度,孵育时保证封闭液完全浸没转印膜。封闭物使用不当。检测生物素标记的蛋白时不可用脱脂奶粉封闭。封闭时间不够。室温37度封闭1小时以上,4度封闭过夜。一抗稀释度不适宜。对抗体进行滴度测试,选择最适宜的抗体稀释度。一抗孵育的温度偏高。建议4℃结合过夜。
3. 膜上出现黑点和黑斑
原因分析
解决方法
膜上其他部位与一抗或二抗非特异性结合,配置的封闭液可能没有完全溶解,使不容颗粒附着在膜上从而导致发光时候膜上形成黑点。
配置封闭液后最好静止一下,封闭牛奶一定要纯,封闭结束之前要清洗三遍之后再加一抗。
抗体与封闭试剂反应。使用前过滤封闭试剂。
HRP 偶联二抗中有聚集体。
过滤二抗试剂,去除聚集体。
4.出现非特异性条带
原因分析
解决方法
一抗非特异性与蛋白结合,此种情况大多数情况是因为一抗特异性不好。
更换一抗。
目的蛋白有多个修饰位点,有些一抗还能结合其他蛋白的结合位点。更换一抗品种。
蛋白样品降解,蛋白酶将目标蛋白分解成若干个蛋白,而这些蛋白同样可以被一抗识别。
添加蛋白酶抑制剂。
5. 条带中出现整条白色空斑
原因分析
解决方法
过高的蛋白上样量或一抗和二抗浓度过高都会促使底物过快的消耗,导致我们在做化学发光检测时,发光底物已经消耗殆尽而形成空斑。
减少蛋白上样量、稀释一抗和二抗的浓度。
6. 条带中出现白圈
原因分析
解决方法
转膜时候,膜与胶之间有气泡。
制作“三明治”时,注意赶走气泡。通常将电转液倒入一个盘子里,液体高度与第一层滤纸齐平,然后往滤纸上浇一些转膜液,把电泳胶用清水清洗后平铺在滤纸上,随后在确认滤纸与胶之间无气泡后,再往胶上浇一些电转液,之后用双手的拇指和食指轻轻夹住PVDF膜两侧中间,使膜成U型,再将U型底部接触到胶的中间,慢慢往两边放下膜,这样可以减少气泡。上层滤纸同样用U型的放置方法,可以用玻璃棒贴实一下,然后盖上海绵垫。
7.条带拖尾
原因分析
解决方法
这种情况很容易出现,因为导致条带拖尾的原因很多,可能性较大的是一抗浓度太高,作用时间太长或蛋白量过大。
根据情况调整蛋白量,同时降低一抗的浓度,缩短一抗的时间。
8. 条带变形
原因分析
解决方法
胶体中存在气泡,或不溶性杂质,胶不均不平整。
配胶时用的小烧杯,水,SDS,tris等等干净无杂质。贴边角加入液体,凝固时避免大幅度动作触碰。
9.条带呈哑铃装
原因分析
解决方法
出现哑铃装条带的问题,最大的可能性就是胶没有配置好,胶凝固后不均一。另外还有一种可能就是样品中含有太多杂质,没有离心下来,然后杂质沉淀在孔的中间,蛋白被挤到两边。把胶配好,不合格的胶坚决不能用。
10. 最边缘条带弯曲
原因分析
解决方法
电泳电流不均一。换电泳槽,或者不使用两边的孔。
11. 背景非均一性
原因分析
解决方法
膜可能干过。
在每一步的操作过程中,都需要注意不要让膜干掉,确保蛋白面不要被风干很长时间,一定要用不漏水的封闭盒并盖上盖子,防止过夜16个小时液体流失。
12. 条带呈“微笑”或“倒微笑”状
原因分析
解决方法
条带呈“微笑U”状,凝胶冷却不均一,电泳槽老化。
更换电泳槽。条带呈“倒微笑∩”装,凝胶左右两头没有凝固好。重新制胶。
13. 其他问题
原因分析
解决方法
蛋白分子量偏高或者偏低。
可能是胶的浓度与目的蛋白的浓度不对应,比如说100KD的蛋白你用12%的胶跑,或者说20KD的蛋白你用6%的胶跑。蛋白质降解。
蛋白质降解后很可能会在比原来位置低的地方出现主带,然后会出现一些其他带,最主要特点是所有的条带比正常的都低,并且条带模糊不清晰。所有条带连成一片没有间隔。原因最可能是上样量过多,其次是样品弥散(比如电泳长时间停止样品弥散)。
以上是我们对WB条带出现各种状况及解决方法的一个总结,希望可以对大家有所帮助。END


本文作者 :上海勤翔

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